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    血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳
    發布日期:2023-03-23 08:26:51


    血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳


    【目的】
    1.掌握電泳法分離蛋白質的原理、操作方法。
    2.了解電泳法分離蛋白質的臨床意義。
    【原理】
    帶電粒子在電場中向與其電性相反的電極泳動的現象稱為電泳。血清中各種蛋白質的等電點大多在pH4.0~7.3之間,在pH8.6的緩沖液中均帶負電荷,在電場中都向正極移動。由于血清中各種蛋白質的等電點不同,因此在同一pH環境中所帶負電荷多少不同,又由于其分子 大小不同,所以在電場中泳動速度也不同。分子小而帶電荷多者,泳動速度較快;反之,則泳動速度較慢。因此通過電泳可將血清蛋白質分為5條區帶,從正極端依次分為清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β-球蛋白和γ球蛋白等,經染色可計算出各蛋白質含量的百分數。
    醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便 、分辨率高等優點,廣泛應用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、結合球蛋白、同工酶的分離和測定。
    【器材】
      醋酸纖維素薄膜(2cm×8cm)、培養皿、濾紙、無齒鑷、剪子、加樣器(可用蓋玻片或X膠片或微量加樣器)、直尺、鉛筆、玻璃板(8cm×12cm)、試管、試管架、吸管、電泳儀 、電泳槽、分光光度計或吸光度掃描計。
    【試劑】
      1. 巴比妥緩沖液(pH8.6,0.07mol/L,離子強度0.06) 稱取巴比妥鈉12.76g、巴比妥1.66g,加500毫升蒸餾水,加熱溶解。待冷至室溫后,再加蒸餾水至1000毫升。
    2. 氨基黑10B染色液 稱取氨基黑10B 0.5g加入冰醋酸10ml、甲醇50ml,混勻,加蒸餾水至100ml。
    3. 漂洗液 甲醇45ml、冰醋酸5ml,混勻后加蒸餾水至100ml。
    4. 洗脫液 0.4mol/LNaOH溶液。
    5. 透明液 稱取檸檬酸21g,N-甲基-2-吡咯烷酮150g,以蒸餾水溶解并稀釋至500ml。
      【操作】
    1. 準備 將緩沖液加入電泳槽 的兩槽內,并使兩側的液面等高。裁剪尺寸合適的濾紙條,疊成四層貼在電泳槽的兩側支架上,一端與支架前沿對齊,另一端侵入電泳槽的緩沖液內,使濾紙全部濕潤,此即 “濾紙橋”(圖3-1)。

    將醋酸纖維素薄膜切成2cm×8cm大小,在無光澤面的一端約1.5cm處,用鉛筆輕劃一直線,作為點樣位置。然后將無光澤面向下,置于盛有巴比妥緩沖液的培養皿中浸泡,待充分浸透(約20分鐘)即無白色斑點后取出,用潔凈濾紙輕輕吸去表面的多余緩沖液。
    2. 點樣 取少量血清于玻璃板上,用加樣器取少量血清(約2~3μl),加在點樣線上,待血清滲入膜內,移開加樣器。點樣時應注意血清要適量,應形成均勻的直線,并避免弄破薄膜(圖3-2)。




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